微生物學通報】基于5′mRNA二級結構優化的鹵醇脫鹵酶高效表達及應用

發布日期：2025-12-19 15:26:29

微生物學通報】基于5′mRNA二級結構優化的鹵醇脫鹵酶高效表達及應用

摘要

目的鹵醇脫鹵酶作為一種生物催化劑，兼具閉環與開環反應活性，在手性環氧化合物等合成領域應用廣泛，其綠色高效制備具有重要意義。本研究通過對鹵醇脫鹵酶HheC編碼序列N端進行基于mRNA二級結構的序列優化，實現HheC的高效表達，并將其應用于手性環氧氯丙烷的合成。

方法采用mRNA預測工具預測5′mRNA二級結構與熱力學性質，以降低mRNA二級結構穩定性、提高折疊自由能(ΔG)為目標，在不改變氨基酸序列的前提下設計高表達5′mRNA序列，并表征酶的表達效率和催化性能。

結果基于5′mRNA序列設計獲得了HheC突變體，其蛋白表達水平從16.71%提升至33.39%，對1,3-二氯-2-丙醇的相對酶活提高了3倍。

結論基于5′mRNA二級結構優化可顯著提高HheC表達水平，提升目標產物合成效率，為構建酶法催化合成手性環氧氯丙烷路線奠定了基礎。

關鍵詞鹵醇脫鹵酶；mRNA二級結構；翻譯表達調控

鹵醇脫鹵酶(halohydrin dehalogenases, HHDHs, EC 4.5.1.X)是一類重要的生物催化劑，它能夠催化鄰鹵醇羥基對鹵素進行分子內親核取代反應，生成對應的環氧化物與鹵化氫；同時，也能催化相應的逆反應，即受N3-、CN-、NO2-等親核試劑進攻，催化環氧化物開環，具有與轉氨酶、大部分脫氫酶類似的雙向催化功能。根據序列同源性與結構特征的差異，鹵醇脫鹵酶可分為A-G等多個亞型[1-2]。其中，HheC對短鏈鄰鹵醇具有高活性和高選擇性，在手性環氧氯丙烷、他汀側鏈、惡唑烷酮等合成中具有重要應用，其高效制備也備受關注[3-4]。

在現代生物技術領域，外源基因在宿主生物中的高效表達已成為眾多應用的基石。影響外源基因在宿主中高效表達的關鍵因素是多方面的，包括基因序列的優化、合適啟動子及調控元件的選擇，以及對宿主細胞翻譯機制的調控。其中，mRNA結構，尤其是5′mRNA二級結構被視為關鍵因素之一。mRNA二級結構能夠顯著影響翻譯起始效率，進而影響所編碼蛋白質的整體表達水平[5-8]。適當的mRNA二級結構有助于蛋白質的正確折疊[5]，改善核糖體的分配，防止核糖體碰撞與堵塞，提高翻譯效率[6,9]。反之，高穩定性的二級結構可能阻礙核糖體的移動，使核糖體需要更長時間解開配對的堿基，導致“翻譯停滯”[8]；核糖體下游高穩定性的二級結構甚至可能引發移碼突變[10]。此外，ΔG是衡量RNA二級結構穩定性的關鍵熱力學參數，反映了RNA分子折疊成特定結構時的能量變化。ΔG越低(即負值越大)表明形成該結構需要釋放更多能量，二級結構越穩定。

對于翻譯起始而言，翻譯起始區(translation initiation region, TIR)是啟動翻譯的重要功能區域，包括核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)、SD序列(Shine-Dalgarno sequence)、起始密碼子及其下游的部分序列[11]。TIR序列對翻譯起始的影響可歸因于區域內mRNA二級結構引起的核糖體可及性差異。TIR內一定程度的mRNA二級結構能夠延長其半衰期，防止其被過早降解[12-13]，且由于30S亞基與RBS之間具有較強的親和力，并不影響二者的結合[14-15]。當mRNA穩定性達到一定閾值時，其穩定性與翻譯效率呈負相關，穩定的二級結構會阻礙二者結合，從而抑制翻譯起始，顯著影響目的基因表達[16-17]。此外，mRNA二級結構在調控目的蛋白表達水平中發揮著多維度作用，涉及核糖體結合效率、翻譯起始復合體組裝、mRNA降解動力學及其與轉錄后調控網絡的耦合機制。結構緊密的5′mRNA二級結構可遮蔽核糖體結合位點(如起始密碼子AUG附近或SD序列)，阻礙小亞基裝載，顯著抑制翻譯起始[18]；還能通過限制eIF4E、eIF4G等起始因子對mRNA帽結構的結合，抑制翻譯起始復合體的形成[19]。由此可見，mRNA二級結構的折疊方式與穩定性能夠通過多種機制影響蛋白質的合成速率，這為聚焦于5′mRNA二級結構設計，提升鹵醇脫鹵酶在大腸桿菌(Escherichia coli)中的異源表達水平提供了重要指導。

本研究以HHDH亞型之一的鹵醇脫鹵酶HheC為研究對象。通過降低編碼序列5′mRNA二級結構穩定性在不改變氨基酸序列的前提下提高HheC在大腸桿菌中的異源表達水平，并表征酶的表達效率及其對1,3-二氯-2-丙醇(1,3-dichloro-2-propanol, 1,3-DCP)的催化性能，以期為手性環氧氯丙烷的酶法合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究使用的表達宿主為E. coli BL21(DE3)，表達載體為pET-28b(+)，二者均由本實驗室保藏；研究對象鹵醇脫鹵酶HheCL143N/A159T/P175S/W249P為實驗室前期構建，標記為HheCM4。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.4。

LB固體培養基：在LB液體培養基的基礎上加入20 g/L的瓊脂粉配制而成。

1.2 mRNA二級結構與熱力學性質預測

1.2.1 基于ViennaRNA的mRNA二級結構與熱力學性質分析

為提高mRNA二級結構預測結果的可信度，準確反映熱力學性質變化趨勢，本研究采用3種不同算法的預測工具對mRNA二級結構與熱力學性質進行分析。利用ViennaRNA在線工具(http://rna.tbi.univie.ac.at/)[20-21]對5′mRNA (基于起始密碼子的80 nt序列)的二級結構、折疊自由能變化(ΔG)及核苷酸熱力學性質進行預測。其mRNA折疊算法包括最小自由能(minimum free energy, MFE)模型與配分函數(partition function)模型。MFE模型通過搜索自由能最低的構象來預測序列最穩定的折疊結構；配分函數模型基于統計力學框架計算所有可能構象的熱力學加權，從而獲得堿基配對概率與結構多樣性信息，并設置避免孤對堿基對(avoid isolated base pairs)以提高預測結果的合理性。選擇Turner模型(2004)[22]的熱力學參數，設定折疊溫度為37 ℃，在1 mol/L鹽濃度下進行能量計算。

1.2.2 基于Mfold的mRNA二級結構與熱力學性質分析

源于UNAFold在線工具(https://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php)的Mfold模塊[23]同樣是基于最小自由能原理開發的核酸二級結構預測算法。其核心采用Zuker等提出的動態規劃(dynamic programming)算法[24]與Turner模型(1999)[25]的熱力學參數系統性地搜索所有可能的堿基配對組合，從而精確識別最穩定構象及多個亞穩態結構。該模塊提供靈活的結構約束功能，支持強制配對、禁配設定和多鏈雜交模擬，在寡核苷酸設計、引物篩選、RNA干擾等領域均有廣泛應用。設定折疊溫度為37 ℃，在1 mol/L鹽濃度下進行能量計算。

1.2.3 基于UFold的mRNA二級結構分析

UFold[26]基于深度學習框架，通過端到端的圖像化神經網絡模型實現高精度與高效率的mRNA二級結構預測。其主體采用U-Net模型[27]全卷積神經網絡架構，能夠在保持位置信息的同時逐層提取局部與全局特征。通過對L×L的配對矩陣進行對稱性處理，篩除不符合RNA二級結構物理約束的配對，并結合線性規劃進行結構優化，最終獲得符合熱力學與幾何限制的穩定二級結構模型。該方法相比傳統自由能最小化方法具有更高的預測準確性與處理效率，在處理假結預測與長程配對識別任務中表現更優秀。

1.3 重組菌株構建

以HheCM4為模板，通過全質粒PCR對目標序列進行突變。質粒DNA由質粒小提試劑盒(購自北京擎科生物科技股份有限公司)提取獲得。引物序列見表1。PCR反應體系(25 μL)：2×Phanta Max Buffer (p505) 12.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 0.5 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板0.1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，30個循環；72 ℃終延伸10 min。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物后，用Dpn I于37 ℃消化模板，通過熱激法將產物轉化至E. coli BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基，37 ℃培養過夜，挑取單菌落送北京擎科生物科技股份有限公司測序驗證。

表1 5′mRNA突變引物序列Table 1 Mutant primers of 5′mRNA sequences

a：下游通用引物。

a: Downstream universal primer.

1.4 目的蛋白誘導表達與分析

1.4.1 誘導表達

挑取重組菌落至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基試管中，于37 ℃、200 r/min培養過夜。按2%體積分數轉接至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37 ℃、180 r/min培養至OD600約為0.6-0.8，加入IPTG (終濃度0.1 mmol/L)進行目標蛋白的誘導表達，28 ℃、180 r/min誘導12 h后，于8 000 r/min離心10 min，去除上清液后得到濕菌體，用于后續的分析與催化反應。

1.4.2 蛋白表達分析

將50 g/L重組菌重懸于PB緩沖液(20 mmol/L, pH 7.4)，在冰水浴下以180 W超聲破碎10 min (超聲時間2 s，間隔時間4 s)至澄清，4 ℃、12 000 r/min離心20 min后，取上清液用PB緩沖液稀釋3倍，并與5×loading buffer按4:1體積比混合，在沸水浴中放置5 min，取4 μL進行SDS-PAGE分析。經染色脫色儀10 min工作程序處理后，在凝膠成像儀下觀察電泳結果。采用圖像處理軟件ImageJ 1.54f對SDS-PAGE圖像進行Rolling ball算法[28]背景校正后取反色，進行目的蛋白表達量的半定量灰度分析。

表達水平與酶活數據包含3個生物學平行重復組，以平均值±標準差(mean±SD)表示。組間顯著差異分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Waller-Duncan多重比較法進行差異檢測。顯著性水平設定為P<0.05，所有統計分析均使用SPSS 27.0軟件完成。

1.5 鹵醇脫鹵酶催化1,3-DCP合成手性環氧氯丙烷

1.5.1 反應體系與反應條件

在20 mL Gly/NaOH緩沖液(600 mmol/L, pH 9.8)與乙酸乙酯體積比為1:1的反應體系中加入含鹵醇脫鹵酶突變體的重組菌0.2 g (終濃度為10 g/L)，400 mmol/L 1,3-DCP，于30 ℃孵育10 min后，180 r/min水浴振蕩反應5 min后取樣，12 000 r/min離心1 min，取上層有機相經無水硫酸鈉處理后進行氣相色譜檢測。

1.5.2 氣相檢測方法

底物1,3-DCP與產物環氧氯丙烷(epichlorohydrin, ECH)使用GC (Agilent公司)進行檢測，具體檢測條件如下：色譜柱型號為BGB-175手性毛細管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)；柱箱條件為初始柱溫100 ℃，保持4 min后以2 ℃/min升溫至110 ℃，而后以30 ℃/min升高至180 ℃，保持3 min。進樣口溫度設定為250 ℃，FID檢測口溫度設定為250 ℃。載氣為高純氮，流量設定為1.5 mL/min，分流比為80:1。

2 結果與分析

2.1 5′mRNA序列設計

基于翻譯起始區TIR中5′mRNA二級結構穩定性與目標蛋白表達水平呈負相關的研究結論[5-8]，本研究通過降低mRNA二級結構穩定性以提高翻譯起始效率，對HheC編碼序列的5′mRNA序列進行優化，從而增加HheC表達。在不改變氨基酸序列的前提下，分別以提高和降低ΔG為目標對序列進行設計，并設計相應引物對5′mRNA核苷酸序列進行突變。其中，2號位丙氨酸插入突變ins2A為實驗中意外所得，上標為相應密碼子編碼的丙氨酸，其余序列均編碼與HheCM4相同的氨基酸。

以起始密碼子上游不同位點作為最小折疊自由能預測的起始位點均能得到相近的自由能預測結果(R2=0.938 5)[29]。因此，本研究以起始密碼子(AUG) 80 nt的序列(-20-60)作為研究對象，預測mRNA二級結構并計算自由能。如表2所示，不同密碼子對應的2號位丙氨酸插入突變體與出發酶HheCM4相比，mRNA二級結構確實存在折疊自由能差異。由此，設計預期mRNA二級結構穩定性降低的高表達突變體HheCM4/H1 (ΔG=-13.20 kcal/mol)與HheCM4/H2 (ΔG=-12.00 kcal/mol)，同時設計預期高穩定性低表達的突變體HheCM4/L1 (ΔG=-21.70 kcal/mol)與HheCM4/L2 (ΔG=-24.10 kcal/mol)用于反向驗證。在此基礎上進一步表征了對應突變體在宿主中的表達水平。

表2 5′mRNA序列設計Table 2 Design of synonymous mutation sequences of 5′mRNA

a：下劃線代表起始密碼；b：源于ViennaRNA；c：源于Mfold。

a: The underline represents the start codon; b: Calculated by ViennaRNA; c: Calculated by Mfold.

2.2 目標蛋白表達水平與催化活性研究

SDS-PAGE圖像與灰度掃描半定量分析結果如圖1所示，出發株HheCM4中HheC (28.7 kDa)占宿主細胞中可溶性蛋白的比例為16.71%。4種插入突變體中，ins2AGCA表達水平變化不顯著(16.61%)，而ins2AGCU、ins2AGCC、ins2AGCG表達水平提升幅度相近，HheC占比分別為25.42%、27.36%與26.71%。序列設計結果中具有更高mRNA穩定性的HheCM4/L2 (12.38%)表達水平低于HheCM4/L1 (14.98%)，且較出發株均有所下降；而具有更低穩定性的HheCM4/H2 (33.39%)表達水平高于HheCM4/H1 (31.78%)，較出發株提升顯著，與設計預期一致。

圖1 HheCM4及其突變體的表達水平Figure 1 Expression levels of HheCM4 and its mutants. A: SDS-PAGE analysis chart of HheCM4 and its mutants (Lane 1: Protein marker; Lane 2: HheCM4; Lane 3: ins2AGCA; Lane 4: ins2AGCU; Lane 5: ins2AGCC; Lane 6: ins2AGCG; Lane 7: HheCM4/L1; Lane 8: HheCM4/L2; Lane 9: HheCM4/H1; Lane 10: HheCM4/H2); B: Comparison of the soluble expression of HheCM4 and its mutants [Different lowercase letters indicate that there are significant differences in the expression level among different strains (P<0.05)].

HheCM4及其突變體的全細胞催化活性測定結果如圖2所示，與表達水平測定結果對應，4種插入突變體中ins2AGCA具有最低的催化活性，較出發株HheCM4不存在顯著變化，而其余3種插入突變體催化活性均有顯著提升。序列設計結果中具有高mRNA穩定性的HheCM4/L1與HheCM4/L2相對酶活均不及出發株，且具有更低ΔG的HheCM4/L2 (57.95%)催化活性低于HheCM4/L1 (72.18%)；而mRNA穩定性更低的HheCM4/H1 (278.85%)與HheCM4/H2 (300.78%)催化活性均存在顯著提升，且具有最高ΔG的HheCM4/H2表現出最高的催化活性，與表達水平以及mRNA結構穩定性預測結果一致。

圖2 HheCM4及其突變體的相對酶活比較Figure 2 Comparison of the relative enzyme activities of HheCM4 and its mutants. Different lowercase letters indicate that there are significant differences in the relative activity among different strains (P<0.05).

基于HheC表達水平與ΔG相關性繪制的散點圖如圖3所示。采用2種不同算法工具得到的ΔG結果均反映mRNA熱力學穩定性與HheC表達量呈負相關性，即隨著自由能ΔG的升高(mRNA穩定性降低) HheC表達量顯著增加，且2種算法的預測結果在分布趨勢與數據密度上基本一致。

圖3 mRNA二級結構折疊自由能(ΔG)與HheC表達水平相關性分析Figure 3 Correlation analysis of the folding free energy (ΔG) of mRNA secondary structure and the expression level of HheC.

2.3 mRNA二級結構分析

MFE結構是依據自由能最小化原則得到的、mRNA二級結構最穩定的構象，代表了熱力學上最可能形成的結構。質心結構(centroid structure)是通過概率模型計算所得的mRNA二級結構，表示熱力學構象集合中最接近平均構象的一種代表性結構[30]。

源于ViennaRNA的5′mRNA MFE二級結構與質心二級結構預測結果如圖4所示。基于熵值對結構進行著色，反映了mRNA在該位置存在不同構象的可能性。熵值趨于0 (暖色調)表明該位點的結構較不穩定，可形成多種不同構象，如環或單鏈結構；熵值趨于冷色調則表明該位點的結構較穩定，通常位于莖(stem)結構中，更易于配對并形成穩定的雙鏈結構。HheCM4二級結構的大部分區域形成了一個緊湊的發夾結構，且MFE結構與質心結構具有較高的相似性(圖4A)，表明該結構具有一定程度的穩定性。HheCM4/H1 (圖4H)與HheCM4/H2 (圖4I)的MFE結構與質心結構相似度較低，存在更多不穩定的非配對結構，因而易于解旋，有助于核糖體快速結合，通過提高翻譯效率增加HheC表達量。相比之下，HheCM4/L1 (圖4F)與HheCM4/L2 (圖4G)的MFE結構與質心結構均呈高度相似的發夾結構，表明兩者具有高度穩定的mRNA二級結構，從而通過阻礙翻譯起始降低HheC表達量。

圖4 ViennaRNA mRNA二級結構預測結果Figure 4 Prediction of mRNA structure by ViennaRNA. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.

源于Mfold的mRNA二級結構預測結果如圖5所示。由于Mfold輸出的mRNA結構僅包括MFE結構或熱力學能量接近MFE的次優結構，因此大多呈現為相似度較高的連續莖環結構。HheCM4 (圖5A)存在多個莖環結構，雙鏈配對區域較為集中；ins2AGCA (圖5B)結構與其高度相似，配對密度略低；而ins2AGCU (圖5C)、ins2AGCC (圖5D)、ins2AGCG (圖5E)三者結構高度相似，發夾短，環結構分布更多，配對密度更低。HheCM4/L1 (圖5F)與HheCM4/L2 (圖5G)存在連續且緊密的長莖結構，雙鏈配對密度顯著提升。HheCM4/H1 (圖5H)雖與HheCM4同樣具有較高的相似度，但配對密度進一步下降，HheCM4/H2 (圖5I)則僅在少量堿基間形成較短的配對。

圖5 Mfold mRNA二級結構預測結果Figure 5 Prediction of mRNA structure by Mfold. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.

源于UFold的mRNA二級結構預測結果如圖6所示。HheCM4 (圖6A)主鏈存在連續的莖區雙鏈配對，而插入突變體(圖6B-6E)莖區長度降低，主鏈存在更多環結構。HheCM4/L1 (圖6F)與HheCM4/L2 (圖6G)存在更長的莖區和更致密的堿基配對，且在HheCM4/L2中尤為顯著。相比之下，HheCM4/H2 (圖6I)配對結構少，莖區結構較短，發夾未完全閉合，同時更復雜的長程相互作用表明其存在更大的三維構象自由度。

圖6 UFold mRNA二級結構預測結果Figure 6 Prediction of mRNA structure by UFold. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.

2.4 熱力學性質分析

山形圖(mountain plot)能夠基于mRNA二級結構的MFE結構自由能、質心結構自由能以及配對(partition function, PF)結構展現序列特定區域的自由能變化。如圖7所示，HheCM4/L1 (圖7F)與HheCM4/L2 (圖7G)的三條曲線高度相似，且HheCM4/L2的MFE與Centroid曲線完全重合，這進一步證明了其mRNA二級結構具有高度穩定性。HheCM4/H1 (圖7H)與HheCM4/H2 (圖7I)相較于HheCM4 (圖7A)自由能更低，并且HheCM4/H2中存在一個顯著的低能量區域，這或許更有利于mRNA二級結構的部分解旋。

圖7 mRNA二級結構山形圖Figure 7 Mountain plot of mRNA secondary structure. A: HheCM4; B: ins2AGCA; C: ins2AGCU; D: ins2AGCC; E: ins2AGCG; F: HheCM4/L1; G: HheCM4/L2; H: HheCM4/H1; I: HheCM4/H2.

熵(entropy)是量化二級結構穩定性變化的一個重要參數，可用于衡量mRNA不同區域的結構可變程度。低熵表示該位置的結構穩定，構象選擇性低，在大多數情況下均能折疊成特定結構；而高熵值則相反，表明二級結構高度動態，構象變化較多。通過對各突變體的mRNA序列進行熵值分析能夠進一步揭示它們之間二級結構的可變性和動態特性。HheCM4、HheCM4/L1、HheCM4/L2中存在更多的低熵區域，表明其大部分區域構象變化受限；而HheCM4/H1、HheCM4/H2中熵普遍較高，表明其二級結構在多個區域存在較大的可變空間。

2.5 高表達HheC催化1,3-DCP合成ECH反應進程

本研究考察了HheCM4及其突變體(5 g/L濕細胞)催化100 mmol/L底物合成ECH的反應進程，結果如圖8所示。受限于鹵醇脫鹵酶的可逆反應，在該體系下的最大產率僅能達到約88%。HheCM4/H1與HheCM4/H2反應5 min時產率即可分別達到14.31%與17.17%，且僅需約50 min即可達到最大產率；而出發株HheCM4反應5 min時產率僅為7.54%，達到同一水平產率需將反應時間延長至約120 min。因此，在實際生產中本研究的高表達突變體能夠有效加速反應進程，在現有體系下完成底物的高效轉化，縮短生產周期，為鹵醇脫鹵酶高效催化1,3-DCP合成ECH奠定重要基礎。

圖8 HheCM4及其突變體催化1,3-DCP合成ECH的反應進程Figure 8 Synthesis of ECH from 1,3-DCP catalyzed by HheCM4 and its mutants.

3 討論與結論

鹵醇脫鹵酶作為一種能夠催化鹵代醇與環氧化物相互轉化的生物催化劑，在環境修復與監測[31-32]、合成藥物手性中間體[3-4]等領域均具有重要的應用價值。另一方面，原核生物的基因表達受mRNA結構的影響。在蛋白質合成過程中，翻譯起始是其中限速且受調控程度最高的階段[11]，易受到mRNA二級結構穩定性的影響。穩定的mRNA二級結構會阻礙核糖體30S亞基與RBS的結合，從而抑制翻譯起始，顯著影響目的基因的表達[9,16-17]，而較低的mRNA二級結構穩定性有利于兩者結合，進而高效啟動翻譯[33-35]。因此，通過序列優化降低翻譯起始區mRNA二級結構的穩定性能夠有效提高翻譯起始效率，實現外源基因在宿主細胞中的高效表達。

本研究基于鹵醇脫鹵酶HheC編碼序列5′端mRNA二級結構與折疊自由能，借助mRNA二級結構預測工具進行計算，在維持氨基酸序列不變的前提下實現了核苷酸序列的優化。最終，使HheC在E. coli BL21(DE3)中的表達水平由占宿主細胞可溶性蛋白的16.71%提升至33.39%，相對酶活提升至原來的3倍。此外，通過負向優化得到的高穩定性5′mRNA序列表現出低表達水平，進一步驗證了HheC 5′mRNA穩定性與其表達水平的相關性。將所得成果應用于催化1,3-DCP合成ECH，在本研究體積比為1:1的Gly/NaOH (600 mmol/L, pH 9.8)與乙酸異丁酯的雙相體系下，高表達HheC通過濕細胞催化100 mmol/L 1,3-DCP合成ECH達到產率上限的反應時間由120 min縮短至50 min。HheC的高效表達不僅能夠提高目標酶的產量，使微量活性差異更易被檢測與量化，從而提升蛋白質工程中突變篩選的靈敏度和效率；而且對于生產應用而言，更易于實現反應體系的高效催化，顯著提高經濟效益，降低生產成本，增強酶催化工藝路線的競爭力。

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